English

ストレス微生物科学研究室ストレス微生物科学研究室

プロテアーゼのフォールディング機構の解明と酵素機能の改変（高木）

　タンパク質工学は、遺伝子工学・タンパク質化学・分子モデリング技術などを駆使し、新機能を有するタンパク質の分子設計、既存タンパク質の機能改良などを行う技術です。私たちは枯草菌が菌体外に分泌し、洗剤添加物や皮革加工などの工業用酵素として世界的に重要なプロテアーゼであるサチライシン（subtilisin）を材料に、タンパク質工学によって多くの機能変換（活性・安定性の向上、基質特異性の改変）に成功してきました。
　一方、サチライシンなどの自己プロセシング型プロテアーゼでは、分子内シャペロンとして機能するプロ配列が、プロテアーゼ配列のアミノ末端に結合した前駆体として生合成され、プロテアーゼのフォールディングを補助した後、自己触媒的に切断、分解されます。私たちは新しい視点からのタンパク質工学として、プロ配列の遺伝子へ積極的に変異を導入して成熟プロテアーゼの機能改変をめざす手法を「プロ配列工学」と名付け、ユニークな基質特異性を獲得した変異型酵素の取得を試みてきました。また、この手法を他の有用プロテアーゼの高機能化に応用することもめざしています。

＜発表論文＞

  1. M. Takahashi, T. Sekine, N. Kuba, S. Nakamori, M. Yasuda and H. Takagi: The production of recombinant APRP, an alkaline protease derived from Bacillus pumilus TYO-67, by in vitro-refolding of pro-enzyme fixed on a solid surface. J. Biochem., 136, 549-556 (2004).
  2. 薮田幸宏, 高木博史：分子内シャペロンによる枯草菌サチライシンのフォールディング機構に関する研究. 応用微生物学研究協議会誌, 2, 1-6 (2004).
  3. 高木博史：プロ配列工学による有用プロテアーゼの高機能化, 日本農芸化学会誌, 78, 754-757 (2004).
  4. 安田正昭, 久場奈緒子, 高木博史：遺伝子組換えによる大豆乳凝集酵素の効率的生産技術, 大豆たんぱく質研究, 6, 43-47 (2003).
  5. H. Takagi and M. Takahashi: A new approach for alteration of protease functions: pro-sequence engineering. Appl. Microbiol. Biotechnol., 63, 1-9 (2003).
  6. H.-C. Mei, Y.-F. Li, C.-C. Hsu, Y.-C. Tsai and H. Takagi: Conversion of the cleavage specificity of subtilisin YaB on oxidized insulin chains to an elastase-like specificity by replacement of Gly124 with Ala. Biosci. Biotech. Biochem., 67, 1601-1604 (2003).
  7. 高橋正和, 高木博史：「プロ配列工学」による酵素機能の改変, バイオサイエンスとインダストリー, 61, 185-186 (2003).
  8. Y. Yabuta, E. Subbian, H. Takagi, U. Shinde and M. Inouye: Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone: dissecting conformational changes coincident with autoprocessing and the role of Ca2+ precursor maturation. J. Biochem., 131, 31-37 (2002).
  9. 高橋正和、高木博史：プロ配列への変異導入による枯草菌プロテアーゼ（サチライシン）の機能改変, 日本生化学会誌, 74, 119-122 (2002).
  10. Y. Yabuta, H. Takagi, M. Inouye and U. Shinde: Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone. Propeptide-release modulates precise activation of a protease. J. Biol. Chem., 276, 44427-44434 (2001).
  11. H. Takagi, M. Koga, S. Katsurada, Y. Yabuta, U. Shinde, M. Inouye and S. Nakamori: Functional analysis of the propeptides of subtilisin E and aqualysin I as intramolecular chaperones. FEBS Lett., 508, 210-214 (2001).
  12. M. Takahashi, Y. Hasuura, S. Nakamori and H. Takagi: Improved autoprocessing efficiency of mutant subtilisins E with altered specificity by engineering of the pro-region. J. Biochem., 130, 99-106 (2001).
  13. H. Takagi: Engineering specificity of Bacillus subtilis subtilisin E. In Recent Research Developments in Protein Engineering, S.G. Pandalai (ed.), pp. 53-74, Research Signpost, Kerala, India (2001).
  14. H. Takagi, K. Hirai, M. Wada and S. Nakamori: Enhanced thermostability of the single-Cys mutant subtilisin E under oxidizing conditions. J. Biochem., 128, 585-589 (2000).
  15. H. Takagi, K. Hirai, Y. Maeda, H. Matsuzawa and S. Nakamori: Engineering subtilisin E for enhanced stability and activity in polar organic solvents. J. Biochem., 127, 617-625 (2000).
  16. H. Takagi, A. Suzumura, Y. Hasuura, T. Hoshino and S. Nakamori: Efficient selection for thermostable protease in Thermus thermophilus. Biosci. Biotech. Biochem., 64, 899-902 (2000).
  17. H. Takagi, A. Suzumura, T. Hoshino and S. Nakamori: Gene expression of Bacillus subtilis subtilisin E in Thermus thermophilus. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 23, 214-217 (1999).
  18. H. Takagi, M. Yamamoto, I. Ohtsu, and S. Nakamori: Random mutagenesis into conserved Gly154 of subtilisin E: isolation and characterization of the revertant enzymes. Protein Engng., 11, 1205-1210 (1998).
  19. H.-C. Mei, Y.-C. Liaw, Y.-C. Li, D.-C. Wang, H. Takagi, and Y.-C. Tsai: Engineering subtilisin YaB: restriction of substrate specificity by the substitution of Gly124 and Gly151 with Ala. Protein Engng., 11, 109-117 (1998).
  20. H.Takagi, I. Ohtsu, and S. Nakamori: Construction of novel subtilisin E with high specificity, activity and productivity through multiple amino acid substitutions. Protein Engng., 10, 985-989 (1997).
  21. 高木博史：蛋白質工学的手法による枯草菌プロテアーゼ・サチライシンの機能変換に関する研究, 日本農芸化学会誌, 71, 995-1002 (1997).
  22. H. Takagi, T. Maeda, I. Ohtsu, Y.-C. Tsai, and S. Nakamori: Restriction of substrate specificity of subtilisin E by introduction of a side chain into a conserved glysine residue. FEBS Letters, 395, 127-132 (1996).
  23. 高木博史：N末端プロペプチドによるタンパク質のフォールディング, バイオサイエンスとインダストリー, 54, 20-25 (1996).
  24. H. Takagi, H. Matsuzawa, T. Ohta, M. Yamasaki and M. Inouye: Studies on the structure and function of subtilisin E by protein engineering. In Subtilisin Enzymes: Practical Protein Engineering, R. Bott and C. Betzel (eds.), pp. 269-275, Prenum Press, New York and London (1996).
  25. H. Takagi: Protein engineering on subtilisin. Int. J. Biochem., 25, 307-312 (1993).
  26. H. Takagi, S. Arafuka, M. Inouye and M. Yamasaki: The effect of amino acid deletion in subtilisin E, based on structural comparison with a microbial alkaline elastase, on its substrate specificity and catalysis. J. Biochem., 111, 584-588 (1992).
  27. H. Takagi, H. Matsuzawa, T. Ohta, M. Yamasaki, and M. Inouye: Studies on the structure and function of subtilisin E by protein engineering. Annals of the New York Academy of Sciences, Vol. 672, 52-59, In C. S. Craik and D. A. Estell (ed.), The New York Academy Sciences, New York (1992).
  28. 高木博史：サチライシン, 蛋白質核酸酵素増刊号「蛋白質工学の進展」, 37, 303-313 (1992).
  29. 高木博史：タンパク質工学による酵素の機能改良, 日本醸造協会誌, 86, 120-125 (1991).
  30. 高木博史：サチライシン (subtilisin) の蛋白質工学, 日本農芸化学会誌, 65, 63-67 (1991).
  31. H. Takagi, T. Takahashi, H. Momose, M. Inouye, Y. Maeda, H. Matsuzawa and T. Ohta: Enhancement of the thermostability of subtilisin E by introduction of a disulfide bond engineered on the basis of structural comparison with a thermophilic serine protease. J. Biol. Chem., 265, 6874-6878 (1990).
  32. H. Takagi, Y. Morinaga, H. Ikemura, and M. Inouye: The role of Pro-239 in the catalysis and heat stability of subtilisin E. J. Biochem., 105, 953-956 (1989).
  33. 高木博史：サチライシン (subtilisin) のタンパク質工学, 生化学, 61, 202-207 (1989).
  34. H. Takagi, Y. Morinaga, H. Ikemura and M. Inouye: Mutant subtilisin E with enhanced protease activity obtained by site-directed mutagenesis. J. Biol. Chem., 263, 19592-19596 (1988).
  35. H. Takagi, Y. Morinaga, M. Tsuchiya, H. Ikemura and M. Inouye: Control of folding of proteins secreted by a high expression secretion vector, pIN-III-ompA: 16-fold increase in production of active subtilisin E in Escherichia coli. Bio/Technology, 6, 948-950 (1988).
  36. 高木博史：部位特異変異によるサチライシンの活性変化, 遺伝, 42, 18-22 (1988).
  37. H. Ikemura, H. Takagi and M. Inouye: Requirement of pro-sequence for the production of active subtilisin E in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 262, 7859-7864 (1987).
PageTop