複製フォークのスピードを調節する分子機構
大腸菌のレプリソームは、DNAポリメラーゼⅢ（Pol Ⅲ）とDnaBヘリカーゼとDnaGプライマーゼを含む巨大な分子マシナリーです。DNA複製では、レプリソームがY字型の複製フォークと共にゲノム上を移動しながら新生DNA鎖を合成します。大腸菌のレプリソームが動いているゲノムDNAは、均一な塩基配列でなく、さらに、核様体（バクテリアの染色体構造）やマクロ･ドメイン構造を形成しています。また、レプリソームは、ゲノム上の多様なDNAトポロジー、あるいは、DNA損傷や転写中のRNA ポリメラーゼとの衝突により複製ストレスを被ったときに減速されると推測されていいます。しかし、大腸菌では、複製フォークの速度を正確に測定できないため、生理的な大腸菌ゲノムでのレプリソームの動態はほとんど解明されていません。私たちは、その解析を可能にする実験系を開発して、複製フォーク（ゲノム上を動いているレプリソーム）の運動ダイナミクスを解析しています。
生理的なゲノムは紫外線や活性酸素のような細胞内外の様々な因子に曝されており、これらの因子によりDNAの傷（DNA損傷）を常に生じています。そのために、細胞はゲノムのDNA損傷をDNA修復機構で絶えず修復しています。しかし、DNA損傷を完全に修復できないままにDNA複製されると、複製フォークがゲノム上のDNA損傷と出会った時に、その進行が阻害されます。このようなDNA損傷によるDNA複製阻害は複製ストレスを生じてゲノムを不安定にし、細胞の生存を脅かします。
そこで、複製ストレスに対処してゲノムを安定に維持するために、細胞はDNA損傷に対する応答機構を備えています。DNA損傷応答機構でDNA損傷に適切に対応できないと、ゲノム不安定性や遺伝子疾患（ヒトの癌）や細胞死を生じます。DNA損傷応答機構で、細胞はDNA修復系を活性化してDNA損傷を修復します。さらに、複製フォークの進行速度を遅くします。この複製フォークの速度をコントロールする機構は、ゲノムの安定性のために非常に重要な役割を担ってます。しかし、複製フォークの速度を遅くする分子機構や、ゲノム安定性に果たす役割の詳細はバクテリアでも真核生物でも全く解っていません。
大腸菌のDNA損傷に対する応答機構はSOS応答と呼ばれており、最も良く研究されている細胞応答です。大腸菌のSOS応答は真核生物の細胞応答に比べてシンプルなので良いモデル実験系です。私たちは、大腸菌のSOS応答の解析も行っています。大腸菌DNAポリメラーゼ IV（DinB)のこれまでの解析結果から、このDNAポリメラーゼがSOS応答時に複製フォークの速度を調節しているというモデルを提唱しています。
この研究テーマに関連する発表論文とその解説
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* Pham M.T., Tan K.W., Sakumura Y., Okumura K., Maki H. and Akiyama T.M. (2013)
A single-molecule approach to DNA replication in Escherichia coli cells demonstrated that DNA polymerase III is a major determinant of fork speed.
Molecular Microbiology, 90, 584-596. (PubMed23998701)解説
DNAコーミング法（DNA combing）は、チミジン類似体(CldUとIdU)で連続してパルス標識した細胞のゲノムDNAを伸ばしてガラス表面に貼り付けた後、類似体を蛍光抗体で標識して、類似体を取り込んだDNA鎖の長さを蛍光顕微鏡で測る実験法です（下図参照）。この方法では、一分子ずつの複製フォークで一定時間あたりに合成されたDNA鎖の長さを測って、複製フォークの単分子速度を決定できます。しかし、大腸菌へのチミジン類似体の取り込み効率が悪いため、大腸菌の複製フォーク速度はこの方法で解析できませんでした。そこで、DNAコーミング法を大腸菌に適用するために、劇的に高い効率でチミジン類似体をゲノムDNAに取り込む新しい大腸菌細胞eCOMB（E. coli for combing）を作成しました。
このeCOMB細胞とDNAコーミング法を用いて、対数増殖期の大腸菌の複製フォーク速度を解析できる実験系を初めて構築して、その単分子速度は653 ± 9塩基/秒（±標準誤差）であると正確に決定しました。また、複製フォーク速度の分布では、550~750塩基/秒の範囲に約2/3の複製フォークが含まれており、複製フォークの速度はゲノムDNA上で比較的均一でした。しかし、複製フォークには、速度の異なる複数のサブグループがある可能性も示唆されました。
次に、複製フォーク速度のペースメーカーの問題にアプローチしました。試験管内での解析から、変異型dnaE173-PolⅢのヌクレオチド重合速度は野生型PolⅢに比べて1/3（約300塩基/秒）に低下しています。この変異型のPolⅢを持つeCOMB細胞を作成して、複製フォーク速度をDNAコーミング法で測定しました。その結果、変異型細胞の複製フォークは、野生型細胞での速度の40 %（264 ± 9塩基/秒）に減速していました。これは、PolⅢによるDNA鎖伸長が複製フォーク速度を決めるペースメーカーであることを示しています。 -
* Ikeda M., Shinozaki Y., Uchida K., Ohshika Y., Furukohri A., Maki H. and Akiyama T.M. (2012)
Quick replication fork stop by overproduction of Escherichia coli DinB produces non-proliferative cells with an aberrant chromosome.
Genes and Genetic Systems, 87, 229-231. (PubMed23229309)解説
DNAポリメラーゼ IVはDNA損傷部位のゲノム複製に働く特別なDNAポリメラーゼです。また、細胞内の分子数に依存して、DNA複製フォークの進行にブレーキをかけます（以下の二つの論文を参照）。
以前、私たちはDNAポリメラーゼ IVを人為的に急激に過剰生産すると、大腸菌のDNA複製フォークの進行が直ちに停止して細胞が致死になることを明らかにしています（以下の内田の論文）。池田の論文では、DNAポリメラーゼ IVを人為的に過剰生産したときの細胞を蛍光顕微鏡やフローサイトメータで解析して、真核生物のアポトーシスのようにゲノムに致死的な損傷を生じていることを明らかにしました。
この論文は、2013年にGGS Prizeを受賞しました。GGS prizeはGGSに掲載された論文を対象として、GGS編集委員・編集顧問による合同会議で選考されて、優れた学術論文1～2編に与えられます。(研究業績のページ) -
* Mori, T., Nakamura, T., Okazaki, N., Furukohri, A., Maki, H. and Akiyama, M.T. (2012)
Escherichia coli DinB inhibit replication fork progression iwthout significantly inducing the SOS responce.
Genes and Genetic Systems, 87, 75-87. (PubMed 22820381)解説
大腸菌でDNA複製フォークの進行がDNA損傷で阻害されると、DNA損傷応答（SOS応答）が誘導されます。SOS応答では、DNA修復や細胞周期調節などに働く約40種類の遺伝子(SOS遺伝子群)の発現が上昇し、一時的に細胞分裂を止めてDNA損傷を直します。このSOS遺伝子群には、dinB遺伝子によってコードされたDNAポリメラーゼ IVもあります。DNAポリメラーゼ IVはDNA損傷部位のゲノム複製に働く特別なDNAポリメラーゼです。SOS応答によってDNA損傷が修復されると、SOS応答はオフになり、正常なDNA複製と細胞増殖が再開します。
以前、私たちはDNAポリメラーゼ IVを人為的に過剰生産すると、大腸菌のDNA複製フォークの進行が阻害されることを明らかにしました（以下の内田の論文）。上記のSOS応答の知識に従うと、SOS応答でDNAポリメラーゼ IVの細胞内分子数が増えたとき、それがさらにDNA複製フォークを阻害するのではないかと予想されます。そうなればDNA修復が終わっても、正常なDNA複製と細胞増殖が再開できません。
この論文では、DNA損傷によるDNA複製フォークの進行阻害と異なり、DNAポリメラーゼ IVによるDNA複製阻害は強くSOS応答を誘導しないことを明らかにしました。この結果は、DNAポリメラーゼがブレーキとして機能して、SOS応答時に複製フォークの速度を負に調節するモデルを指示します。また、この論文は三名の修士課程の大学院生が行った研究成果をまとめたものです。 -
Uchida, K., Furukohri, A., Shinozaki, Y., Mori, T., Ogawara, D., Kanaya, S., Nohmi, T., Maki, H. and Akiyama, M. (2008).
Overproduction of Escherichia coli DNA polymerase DinB (Pol IV) inhibits replication fork progression and is lethal.
Molecular Microbiology, 70, 608-622. (PubMed 18761688)解説
大腸菌でDNA複製フォークの進行がDNA損傷で阻害されると、DNA損傷応答（SOS応答）が誘導されます。SOS応答では、DNA修復や細胞周期調節などに働く約40種類の遺伝子(SOS遺伝子群)の発現が上昇し、一時的に細胞分裂を止めてDNA損傷を直します。このSOS遺伝子群は、dinB遺伝子によってコードされたDNAポリメラーゼ IVがあります。DNAポリメラーゼ IVはDNA損傷部位のゲノム複製に働く特別なDNAポリメラーゼです。DNAポリメラーゼ IVは、ヒト細胞にも存在し、DNAポイメラーゼ κ（カッパ）と呼ばれています。
私たちはDNAポリメラーゼ IVを大腸菌で人為的に過剰生産すると、その発現量に依存して大腸菌のDNA複製フォークの進行が阻害されることを、マイクロアレイを用いた実験やDNAポリメラーゼ IVの生化学実験等で明らかにしました。この結果などから、私たちは、DNAポリメラーゼが複製フォークのブレーキとして機能して、DNA複製の速度を負にコントロールする新しいモデルを提唱しています。
